Reverse transcriptaza (ADN polimeraza inversă sau dependentă de ARN) este o enzimă care catalizează sinteza ADN-ului pe o matriță de ARN într-un proces numit „ transcriere inversă”. Numele procesului reflectă opusul procesului transcrieri, efectuat în cealaltă direcție: o transcriere de ARN este sintetizată dintr-o moleculă șablon de ADN.
Aceste enzime au fost izolate din virusurile ARN ( retrovirusuri). Transcriptaza inversă este utilizată de virusurile tumorale pentru a transcrie ARNm în catena complementară de ADN. La studierea retrovirusurilor, al căror genom este reprezentat de molecule de ARN monocatenar, s-a descoperit că, în timpul dezvoltării intracelulare, retrovirusul trece prin etapa de integrare a genomului său sub formă de ADN dublu catenar în cromozomii gazdei. celulă. În 1964, Temin a emis ipoteza existenței unei enzime specifice virusului capabilă să sintetizeze ADN complementar pe un șablon de ARN. Eforturile care vizează izolarea unei astfel de enzime au fost încununate cu succes, iar în 1970 Temin și Mizutani, precum și, independent, Baltimore au descoperit enzima dorită într-un preparat de virioni extracelulari ai virusului sarcomului Rous. Această ADN polimerază dependentă de ARN se numește transcriptază inversă sau revertază.
Revertaza din retrovirusurile aviare a fost studiată în cele mai multe detalii. Fiecare virion conține aproximativ 50 de molecule din această enzimă. Reverse transcriptaza constă din două subunități - a (65 kDa) și b (95 kDa), prezente în cantități echimolare. Reverse transcriptaza are cel puțin trei activități enzimatice:
1) ADN polimeraza, care folosește atât ARN, cât și ADN ca șablon;
2) activitatea RNazei H, care hidrolizează ARN-ul ca parte a unui hibrid ARN-ADN;
3) Activitatea ADN-endonucleazei.
Primele două activități sunt necesare pentru sinteza ADN-ului viral, iar endonucleaza pare a fi importantă pentru integrarea ADN-ului viral în genomul celulei gazdă. Transcriptaza inversă purificată sintetizează ADN-ul atât pe șablonele ARN, cât și pe ADN (Fig. 11).
Orez. 11. Schema pentru sinteza de copii ADN dublu catenar ale moleculelor de ARN
Pentru a începe sinteza, reversază, ca și alte polimeraze, necesită o regiune dublu catenară scurtă (amors). Primerul poate fi un segment monocatenar atât de ARN cât și de ADN, care în timpul reacției devin legat covalent de lanțul de ADN nou sintetizat. În inginerie genetică, sunt utilizați ambii primeri oligo-(dT), complementari capetelor 3"-poliA ale ARNm, și un set de hexanucleotide „aleatoriu” în compoziție și secvență (primeri aleatori). Adesea pentru moleculele de ARN cu un primar cunoscut. secvența care nu are capete 3"-poli(A) utilizează oligonucleotide sintetizate chimic complementare capătului 3"
Reverse transcriptaza este utilizată în principal pentru a transcrie ARN mesager în ADN complementar (ADNc). Reacția de transcripție inversă este efectuată în condiții special selectate folosind inhibitori puternici ai activității RNazei. În acest caz, este posibil să se obțină copii ADN cu lungime completă ale moleculelor de ARN țintă. După sinteza unei catene de ADN complementare pe ARNm și distrugerea ARN-ului (de obicei se utilizează tratamentul cu alcalii), se realizează sinteza celei de-a doua catene de ADN. În acest caz, este utilizată capacitatea revertasezei de a forma agrafe de păr auto-complementare la capetele de 3" ale cADN-urilor monocatenar, care pot servi ca primer.
Șablonul este prima catenă de ADNc. Această reacție poate fi catalizată fie prin reversease, fie prin ADN polimeraza I a E. coli. S-a demonstrat că combinația acestor două enzime face posibilă creșterea randamentului moleculelor complete de ADNc dublu catenar. La sfârșitul sintezei, prima și a doua catenă de ADNc rămân legate covalent prin bucla ac de păr care a servit ca primer în timpul sintezei celei de-a doua catene. Această buclă este scindată de endonucleaza S1, care distruge în mod specific secțiunile monocatenar ale acizilor nucleici. Capetele formate în acest caz nu sunt întotdeauna tocite și pentru a crește eficiența clonării ulterioare, acestea sunt reparate pentru a se toci folosind fragmentul Klenow al ADN polimerazei I de E. coli. ADNc-ul dublu catenar rezultat poate fi apoi inserat în vectori de donare, propagat ca parte a moleculelor de ADN hibrid și utilizat pentru cercetări ulterioare.
Se numește astfel deoarece majoritatea proceselor de transcripție în organismele vii au loc în cealaltă direcție, și anume, un transcript de ARN este sintetizat dintr-o moleculă de ADN.
Poveste
Reverse transcriptaza a fost descoperită de Howard Temin la Universitatea din Wisconsin-Madison și independent de David Baltimore în 1970. Ambii cercetători au primit Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină în 1975, împreună cu Renato Dulbecco.
Acuratețea transcripției
Transcripția inversă de la ARN la ADN este însoțită de un nivel ridicat de erori de translație, aceasta diferențiază transcriptaza inversă de alte ADN polimeraze. Aceste erori pot duce la mutații responsabile de rezistența la medicamente a virusurilor.
Importanța pentru viruși
Transcrierea inversă este necesară, în special, pentru implementare ciclu de viață retrovirusuri, cum ar fi virusul imunodeficienței umane și limfomul cu celule T umane tipurile 1 și 2. După ce ARN-ul viral intră în celulă, transcriptaza inversă conținută în particulele virale sintetizează ADN complementar acestuia, iar apoi pe această catenă de ADN, ca pe o matrice, completează a doua catenă.
Semnificație pentru eucariote
Aplicație
Terapia antiretrovirală
Rolul în ingineria genetică
În inginerie genetică, transcriptaza inversă este utilizată pentru a produce ADNc, o copie a unei gene eucariote care nu conține introni. Pentru a face acest lucru, ARNm matur (care codifică produsul genetic corespunzător: proteină, ARN) este izolat din organism și se realizează transcripția inversă cu acesta ca șablon. ADNc rezultat poate fi transformat în celule bacteriene pentru a produce un produs transgenic.
Vezi de asemenea
Scrieți o recenzie despre articolul „Reverse transcriptase”
Note
Extras care caracterizează Reverse Transcriptaza
- DESPRE! O! O!- Ei bine, la revedere, Bolkonsky! La revedere, printe; „Vino la cină mai devreme”, s-au auzit voci. - Avem grijă de tine.
„Încercați pe cât posibil să lăudați ordinea în livrarea proviziilor și a rutelor atunci când vorbiți cu împăratul”, a spus Bilibin, escortându-l pe Bolkonsky în holul din față.
„Și aș vrea să laud, dar nu pot, din câte știu”, a răspuns Bolkonsky zâmbind.
- Ei bine, în general, vorbiți cât mai mult posibil. Pasiunea lui este publicul; dar lui însuși nu-i place să vorbească și nu știe cum, după cum veți vedea.
La ieșire, împăratul Franz s-a uitat doar cu atenție la fața prințului Andrei, care stătea în locul stabilit între ofițerii austrieci, și dădu din cap spre el. Dar după ce a părăsit aripa de ieri, adjutantul i-a transmis politicos lui Bolkonsky dorința împăratului de a-i oferi audiență.
Împăratul Franz l-a primit, stând în mijlocul încăperii. Înainte de a începe conversația, prințul Andrei a fost lovit de faptul că împăratul părea derutat, neștiind ce să spună, și s-a înroșit.
– Spune-mi, când a început bătălia? – întrebă el în grabă.
a răspuns prințul Andrei. Această întrebare a fost urmată de alte întrebări, la fel de simple: „Este sănătos Kutuzov? Cât timp în urmă a părăsit Krems? etc. Împăratul vorbea cu o asemenea expresie de parcă tot scopul lui ar fi fost doar să pună un anumit număr de întrebări. Răspunsurile la aceste întrebări, așa cum era prea evident, nu l-au putut interesa.
– La ce oră a început bătălia? – a întrebat împăratul.
„Nu pot să-i spun Majestății Voastre la ce oră a început bătălia de pe front, dar în Dürenstein, unde mă aflam, armata a început atacul la ora 6 seara”, a spus Bolkonsky, însuflețit și în același timp. timp presupunând că va fi capabil să prezinte ceea ce era deja gata în capul lui o descriere adevărată a tot ceea ce știa și vedea.
Dar împăratul a zâmbit și l-a întrerupt:
- Câte mile?
- De unde și până unde, Maiestate?
– De la Durenstein la Krems?
- La trei mile și jumătate, Maiestate.
-Francezii au părăsit malul stâng?
„După cum au raportat cercetașii, ultimii au traversat pe plute în acea noapte.
– Există suficient furaj în Krems?
– Furajul nu a fost livrat în acea cantitate...
Îl întrerupse împăratul.
– La ce oră a fost ucis generalul Schmit?...
- La ora șapte, cred.
- La ora 7. Foarte trist! Foarte trist!
Împăratul a spus mulțumiri și s-a înclinat. Prințul Andrei a ieșit și a fost imediat înconjurat din toate părțile de curteni. Ochi amabili îl priveau din toate părțile și se auziră cuvinte blânde. Adjutantul de ieri i-a reproșat că nu a stat la palat și i-a oferit casa lui. Ministrul de Război s-a apropiat, felicitându-l pentru Ordinul Maria Tereza, clasa a III-a, pe care împăratul i-l dăruise. Camerelul împărătesei l-a invitat să-l vadă pe Majestatea Sa. Arhiducesa a vrut să-l vadă și ea. Nu știa cui să răspundă și i-a luat câteva secunde să-și adună gândurile. Trimisul rus l-a luat de umăr, l-a dus la fereastră și a început să vorbească cu el.
Contrar cuvintelor lui Bilibin, vestea pe care a adus-o a fost primită cu bucurie. A fost programată o slujbă de mulțumire. Kutuzov a fost distins cu Marea Cruce de Maria Tereza, iar întreaga armată a primit decorații. Bolkonsky a primit invitații din toate părțile și a trebuit să facă vizite la principalii demnitari ai Austriei toată dimineața. După ce și-a încheiat vizitele la ora cinci seara, compunând mental o scrisoare către tatăl său despre bătălie și despre călătoria sa la Brunn, prințul Andrei s-a întors acasă la Bilibin. În pridvorul casei ocupate de Bilibin, stătea o britzka pe jumătate plină cu bunuri, iar Franz, servitorul lui Bilibin, târându-și cu greu valiza, a ieșit pe ușă.
Revertaza este o enzimă care sintetizează ADNc pe un matriță de ARN.
Pentru unii virusuri, genomul nu este ADN, ca de obicei, ci ARN. Astfel de viruși au fost numiți retrovirusuri (retro - invers). În 1970, D. Baltimore și Kh.M Temin au descoperit mecanismul transferului de informații de la ARN viral la ADN, adică. opusul a ceea ce se întâmplă în celulele organismelor superioare. Acest proces se numește transcriere inversă, iar enzima care o desfășoară a fost numită revers transcriptază sau revertază.
Reverse transcriptaza, sau reverse transcriptaza, [lat. transcrierea- rescriere) - enzima ADN polimeraza dependentă de ARN, cu ajutorul căreia se realizează transcripția inversă - sinteza ADN-ului pe o matrice de ARN; codificat de genomul unor virusuri care conțin ARN și elemente genetice mobile ale genomului organismelor superioare, un „instrument” important pentru inginerie genetică. Reverse transcriptaza are cel puțin trei activități enzimatice:
1) ADN polimeraza, care folosește atât ARN, cât și ADN ca șablon;
2) activitatea RNazei H, care hidrolizează ARN-ul ca parte a unui hibrid ARN-ADN, dar nu ARN monocatenar sau dublu și
3) Activitatea ADN-endonucleazei.
Descoperit independent de D. Baltimore și H. Temin în 1970 în virusurile tumorale care conțin ARN (Premiul Nobel pentru 1975 împreună cu R. Dulbecco).
Deci, transcriptazele inverse sunt capabile să sintetizeze ADN pe o matriță de ARN prin polimerizarea a patru trifosfați dezoxiribonucleozidici. Și la fel ca ADN-polimerazele, ele funcționează numai în prezența unui primer.
Transcriptazele inverse sunt utilizate în sinteza ADN-ului dublu catenar, complementar ARN-ului (în special ARNm), pentru donarea ulterioară a acestuia în vectori plasmidii la primire biblioteci de ADNc. Transcriptazele inverse, cum ar fi ADN polimerazele, pot fi utilizate pentru a introduce o etichetă radioactivă sau fluorescentă în sondele ADN în trifosfați dezoxiribonucleozidici marcați corespunzător.
Capacitatea de a sintetiza ADN dintr-un matriță de ARN în anumite condiții a fost demonstrată pentru ADN polimerază termostabilă Thermus thermophilus. Acest lucru îi permite să fie utilizat pentru detectarea directă a ARN-urilor specifice în probele biologice. Metoda PCR. Modificările moderne ale acestei abordări fac posibilă, într-un amestec de reacție (și eprubetă), sintetizarea într-o reacție de transcripție inversă a unui număr mic de copii ale fragmentului de ADN amplificat pe un șablon de ARN, care sunt imediat utilizate de aceeași enzimă ca și un șablon în PCR convențională (PCR cu un tub).
